在生物學研究中，科學家就像拿著放大鏡探索未知世界的孩子，而顯微成像技術就是他們最重要的“觀察工具”。自 17 世紀列文虎克發明顯微鏡以來，可視化觀察始終是生命科學研究的基石。

麻省理工學院麥戈文大腦研究所 Edward Boyden 教授實驗室的科研人員一直致力於提升生物成像技術，以便更清晰地揭示微觀世界中的生命現象。

他們通過引入兩種全新方法進一步增強了“擴張顯微技術”（也稱為膨脹顯微成像技術，是該團隊在 2015 年開發的一種高解析度成像技術）的功能。這些技術改進讓研究人員能夠使用普通的光學顯微鏡來觀察細胞和組織時獲取更加豐富、有價值的資訊。

圖｜使用 multiExR 技術捕捉到的幾種突觸、β-澱粉樣蛋白及其他細胞類型標記蛋白（來源：MIT News）

“我們致力於全面瞭解生命的每一個細節，通過不斷進行技術優化，目標是捕捉所有生命瞬間，尤其是那些最基本的構成要素。”麻省理工學院神經科學教授 Boyden 表示，他同時也是霍華德休斯醫學研究所的研究員。

通過對樣品染色及圖像處理的創新方法，“擴張顯微技術”能夠展示出細胞形狀的生動輪廓，還能精準定位單個組織樣品中多種不同蛋白質的位置。這種方法的解析度遠超傳統光學顯微鏡，為研究提供了新的視角。比如追蹤神經元的纖細突起，或是探索與健康和疾病相關的分子空間關係。

從技術角度看，擴張顯微的工作機制其實是利用吸水性水凝膠使生物組織物理膨脹。具體來說，先用水凝膠滲透組織樣本，然後通過吸收水分讓其逐漸膨脹，從而將細胞成分分離但保持它們在組織內的相對位置不變。

這樣一來，在光學顯微鏡下觀察膨脹后的組織時，原本密集難辨的細胞結構變得一目了然。更重要的是，這種技術只需要常規實驗室設備即可實現，大大降低了超解析度成像的門檻，使得更多的研究團隊能夠運用這一先進技術。

細胞膜可視化

自從首次開發這種膨脹顯微成像技術以來，Boyden 和團隊就不斷優化這項技術，比如提高解析度，簡化操作流程，以及添加新的功能並將其與其他工具整合，以更好地服務於科學研究。

近期，他們取得了一項新突破，開發出一種名為“超微結構膜膨脹顯微成像技術（umExM）”，目前，這項研究成果已經發表在 Nature Communications 上。

借助 umExM 技術，生物學家能夠運用擴張顯微鏡觀察形成細胞邊界、包裹細胞器的薄膜。這些薄膜主要由脂質分子構成，在完整組織中難以密集標記，從而限制了它們在光學顯微鏡下的應用，如今科學家們通過 umExM 可以深入研究組織內的細胞超微結構，揭示更多細節。

Tay Shin 是 umExM 技術的主要開發者之一，他曾是 Boyden 實驗室的研究生，現任職於麻省理工學院 Tan-Yang 自閉症研究中心。“最初我們的目標很簡單，就像電子顯微鏡使用四氧化鋣標記膜來觀察組織中的膜那樣，我們也想對完整組織中的膜進行標記。但實際操作起來，難度遠超預期。”他回憶道。

在該項研究中，他們首先設計了一種能夠在光學顯微鏡下使組織樣本中的膜可見的標記物。“我們幾乎是從零開始。”Shin 說，“我們必須深入思考標記質膜的探針應具備的基本特性，再考慮如何將其融入擴張顯微技術中。”

這意味著要設計一種既能與構成膜的脂質相結合，又能連接到用於膨脹組織樣本的水凝膠和螢光分子上的分子，以便增強可見性。

經過對用於膜可視化的擴張顯微鏡方案的優化，以及對潛在探針的大量測試和改進，Shin 最終取得了成功：當他把經過膨脹處理的組織樣本放在顯微鏡下時，清晰地看到了細胞的輪廓。

憑藉擴張顯微技術帶來的高解析度，umExM 技術讓 Boyden 團隊能夠識別神經元突起的微小樹突，並清晰觀察到細長軸突的延伸。

研究人員認為，這種高清晰度有助於在大腦錯綜複雜的神經網路中追蹤單個神經元的路徑。

在 Boyden 看來，追蹤這些神經過程是“我們這個時代腦科學研究的一項首要任務”。

以往，這類追蹤工作主要依賴電子顯微鏡，但電子顯微鏡不僅對操作人員的專業技能要求高，設備成本也十分昂貴。“擴張顯微鏡使用的是標準光學顯微鏡，全球各地的實驗室更容易獲取。”Shin 指出，

Shin 和 Boyden 還提到，當通過擴張顯微鏡將揭示脂質膜的新功能與顯示特定蛋白質位置的螢游標記相結合時，能讓研究人員對樣品有更加深入的瞭解。

“蛋白質承擔著細胞內的眾多重要功能，瞭解它們在細胞結構中的位置至關重要。通過這種方式，不僅可以更全面地瞭解細胞內部的工作機制，還能為未來的研究提供更多的可能性。”Boyden 解釋說。

一個樣品可分析多種蛋白質

如今，研究人員使用擴張顯微技術時無需再局限於觀察幾種蛋白質。通過一種名為“多重擴張現顯示技術（multiExR）”的新方法，他們能夠在單個樣品中標記並觀察 20 多種不同的蛋白質。

除此之外，這種新方法使得生物學家能夠可視化蛋白質集合，觀察它們如何相互組織，進而對蛋白質間的相互作用提出新的假設。

這種新方法的關鍵在於，能夠將螢游標記的抗體與膨脹后的組織樣本中的特定蛋白質進行重複連接。換句話說，完成一輪成像后，研究人員會剝離這些抗體，然後使用一組新的抗體來揭示另一組新的蛋白質。

麻省理工學院博士後 Jinyoung Kang 對這一過程的每一步都進行了精細調整，確保組織樣本保持完整，並且標記的蛋白質在每一輪成像中都能產生清晰明亮的信號。

在捕捉了單個樣品的大量圖像后，Boyden 團隊又遇到了新挑戰：如何保證這些圖像精準對齊，以便相互疊加生成最終圖像，精確呈現所有標記和可視化蛋白質的位置。

儘管擴張顯微技術讓研究人員觀察到細胞的細微特徵，但在多輪成像中反覆找到相同特徵並非易事。Boyden 實驗室的研究生 Margaret Schroeder 解釋道：“顯微鏡的視場非常小，在凝膠中尋找這個微小視場時，一旦樣品膨脹實際視場會變得很大。”針對這個問題，Schroeder 與 Kang 共同主導了 multiExR 技術的開發。

為了每次都能定位到正確位置，團隊決定標記穿過每個組織樣本的血管，並將其用作引導。同時，為了實現精確對齊，他們還標記了幾種結構蛋白作為參考點。

借助這些參考點和定製的圖像處理軟體，團隊成功將樣品的所有圖像整合為一張，清晰展示出單獨可視化的蛋白質的排列方式。

該團隊運用 multiExR 技術觀察了阿爾茨海默病患者大腦中的澱粉樣蛋白斑塊（一種異常蛋白質簇）。“我們可以深入觀察這些澱粉樣蛋白斑塊內部，探究其中的成分。由於能夠對多種不同蛋白質進行染色，我們得以進行高通量探索。” Boyden 表示。

在一次實驗中，團隊在圖像中選擇觀察 23 種不同的蛋白質，結果有了意外發現：觀察到某些神經遞質受體的存在。Boyden 驚歎道：“這是神經科學領域最知名的受體之一，它竟隱藏在神經科學中最具代表性的病理學分子標誌“澱粉樣蛋白斑塊”內部。”

目前，尚不清楚該受體在阿爾茨海默病中扮演何種角色，但這一發現已經充分表明，更深入觀察細胞內部的能力能夠揭示生物學中意想不到的現象，為後續研究提供新的途徑。

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